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伪狂犬病毒表达载体的研究进展

时间:2016-03-28 10:27来源:猪业科学 作者:赵军、黄剑波等 点击:

导语:伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的多种以动物发热、奇痒及中枢神经障碍为主要症状的一种急性传染病。猪是PRV的主要宿主,成年猪一般为隐性感染,但终身带毒和排毒,可致妊娠母猪流产、死产或产木乃伊胎。该病最早于1813年在美国牛群中发现,由于临床表现与狂犬病类似,故称伪狂犬病。1902年Aujeszky证明该病病原为病毒,因而该病亦被称为奥耶斯基病。因其具有流行快,传播途径多,病死率高的特点,现在已成为对全球养猪业危害最大的传染病之一。每年给养猪业造成了巨大的经济损失,被世界动物卫生组织列为二类动物传染病。目前在生产养殖上常使用伪狂犬常规疫苗来预防本病发生,但常规疫苗在免疫时常出现毒力返强、散毒、免疫效率较低、过敏反应、用量较大等弊端。近年来,随着分子生物学技术的发展,关于伪狂犬病病毒的分子生物学研究取得了很大进展,若将外源基因插入到伪狂犬病病毒基因组中构建出重组病毒,不仅保持了原病毒良好的抗原性,且其毒力不返强,易与野毒区别。利用伪狂犬病病毒作为载体同目的基因一起在动物体内表达,既安全又可达到一针多防的效果,对多种动物疫病的防控具有重大意义。


 

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PRV基因组的结构

猪伪狂犬病毒(PRV)属于疱疹病毒科α-病毒亚科的猪疱疹病毒I型。病毒基因组为线状双链DNA,长度约为150 kb,C+G含量约为74%,由长独特区(UL)和短独特区(US),以及US两侧的重复序列(TRS)与内部重复序列(IRS)所组成。US和UL区段,含有至少70个基因,可编码70-100种蛋白质,成熟的病毒粒子只含有约50种蛋白质。其中在US区段的gD、gE、gG、gI、蛋白激酶基因、1lK和28K 8种蛋白基因已被鉴定;在UL区段有58种基因已经被鉴定,包括gB(gⅡ)、gC(gⅢ)、gH、gK、gL、gM、gN、碱性核酸酶(AN)、核糖核苷还原酶(RR)、DNA多聚酶(POL)、136 ku DNA结合蛋白质(DBP)、主要衣壳蛋白(MCP)和早期蛋白0(EP0)等基因。这些基因可编码结构蛋白、转录调节因子、毒力蛋白、酶类以及与病毒DNA复制、病毒释放有关的蛋白。在这些已经鉴定的伪狂犬病病毒基因中,病毒在细胞中增殖的非必需基因超过一半。另外,还有些已知的毒力基因,如gD、gE、TK等缺失突变之后能显著降低PRV的毒力,这部分DNA序列或基因可以通过缺失处理并被外源DNA置换,而仍使病毒正常生长,成为PRV作为外源基因表达系统的基础。

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伪狂犬病毒载体的优势

 

2.1  安全性好

PRV不感染人,现有的活疫苗株Banha-K61或“783”等已在世界范围内应用了几十年,安全有效,一些国家还通过其消灭和根除了伪狂犬病。因此以PRV疫苗株为载体,在其基因组非必需区上插入外源基因获得的重组病毒在安全性上值得肯定。

2.2  外源基因容量大

目前在PRV长达143Kb的基因组中,大约有一半基因被认为是非必需的。其中有些基因与病毒毒力有关,如gI、gE、gM、TK、PK、gC和dUTPase等。这些基因的缺失或失活会不同程度地降低病毒的毒力,便于在多个非生长必需区内先后或同时插入和表达数种外源基因而不显著影响其生长繁殖,重组出具有各种应用途径的载体。

2.3  生产工艺简单,原材料来源方便

PRV疫苗以接种无特定病原体(SPF)鸡胚成纤维细胞生产,目前包括我国在内的大部分疫苗生产国都已掌握了SPF鸡繁殖与生产技术,原材料来源有充足的保障。因而利用PRV为载体表达其他外源基因生产重组疫苗不需考虑病原生产工艺和材料来源方面的难题。

2.4  生产成本低

由于PRV免疫原性好,5 000 TCID50的毒量就足以抵抗PRV强毒的攻击,而其病毒滴度往往高于105TCID,大大降低了生产成本,也减少了过多外源物质对机体的刺激。

2.5  宿主范围广

牛、山羊、绵羊、猪、猫、狗等家畜和经济动物(如狐和貂)以及鹿等多种野生动物都可感染PRV,使对伪狂犬病毒载体的研究能适用于多种动物,研究价值高。

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重组伪狂犬病毒的构建

3.1  构建原理

重组伪狂犬病毒的构建大致分两部分进行:第一步是重组质粒的构建。所选质粒应含有启动子,并且要在其下游接表达的外源基因,有时要插入有启动子标记的基因如LacZ等以方便筛选,它们的两侧应是伪狂犬病毒特异的DNA同源序列;第二步是将重组质粒导入伪狂犬病毒感染的细胞中,使伪狂犬病毒DNA与重组质粒中的同源序列在细胞内发生同源重组,从而将外源基因装到伪狂犬病毒基因组的特定部位,构建出重组病毒。

3.2  转移载体的构建

在构建重组伪狂犬病病毒的研究过程中,多种转移载体都可用来作为构建重组病毒的工具,业界目前已有乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、狂犬病毒、猪蓝耳病毒等相关基因克隆到通用载体上成功构建转移载体的报道。克隆转移载体没有优劣之分,而是以能否正确地达到构建的目的作为选择标准;但为了使构建及鉴定过程顺利进行,有时可能需要对某些载体进行特定的优化改造。

3.3  伪狂犬基因缺失突变株的制备

在已有的研究报道中,多数学者采取了缺失gE、gI、TK基因中的一个或多个,也有部分研究对gG、gH进行了缺失突变。试验结果均表明,缺失这些病毒复制非必需的基因,不仅会使病毒毒力大大降低,还不会影响病毒的免疫原性和增殖程序,这使得用PRV基因缺失突变株研制活载体疫苗具有可行性。缺失其他基因是否会有同样的作用、基因缺失与插入是否会影响病毒的增殖及免疫原性等也值得进一步探讨。

3.4  转染方法

一般采用磷酸钙法和脂质体法进行转染。磷酸钙法可广泛用于转染许多不同类型的细胞,不但适用于短暂表达,也可生成稳定的转化产物。但对转染过程要求较严格,整个转染过程中都应无菌操作,确保形成尽可能细小的沉淀物,在试验中使用的每种试剂都必须小心校准。由于磷酸钙法要求很严格,而脂质体法相对来说更简单,所以用脂质体法相对较普遍。

脂质体法具有操作简便,转化效率高的特点,可以用于瞬时转染,也可以用在永久表达系的建立,对细胞类型的运用面广,对转染的核酸类型和分子质量有很高的包容性,细胞毒性小,也可以用于体内的基因转染。因此脂质体转染法得到了越来越广泛的应用。但转染温度、时间、DNA与脂质体的比率等对转染均有影响,其中DNA与脂质体的比率是关键。

3.5  筛选方法

目前基因重组研究中常用β-半乳糖苷酶基因(LacZ)和绿色荧光蛋白基因(GFP)作为报告基因对重组病毒进行筛选转化。运用插入报告基因的方法,将LacZ基因或者抗生素基因等与外源基因同时导入伪狂犬病毒基因组中,通过在培养液中加入Xgal、G418等试剂,筛选出重组病毒。

报告基因的应用使得重组子的筛选非常方便。GFP既对细胞没有损害,且直观易用,与其他标记物相比具有更高的灵敏度和分辨率。而LacZ常被用于转化菌株的筛选。此两种报告基因,均有方便直观的特点,目前在伪狂犬病病毒活载体疫苗的研究中常被用到。

3.6   外源基因的表达调控结构

目前,构建重组伪狂犬病毒所选用的主要是gG、gE启动子,其结构独特且活性较强,另外还有gD、CMV。一般说来,启动子序列距外源基因起始密码子越近时表达效果越好。

3.7  构建重组病毒注意事项

复制非必需区TK、gG、gE基因是目前应用较多的同源序列。再者,选用的亲本病毒株最好是目前常规使用的疫苗株,从而才能够不引起宿主发病;再就是考虑其亲本株的宿主特异性,以对其他动物不构成威胁为前提。最后还要考虑到它所诱导的保护性免疫应答的类型,是全身性免疫应答还是局部的黏膜免疫应答,以便构建对应类型的重组载体,研制适用的重组疫苗。

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国内外伪狂犬病毒表达载体的研究进展

自1984年首次报道可以将HSV-1作为表达外源基因的载体以来,疱疹病毒作为载体得到了深入研究和广泛应用。PRV的基因结构和功能与单纯疱疹病毒的很相似,这就为PRV在载体方面研究提供了模型。Keeler C L等最早用PRV作为载体表达了g-β-半乳糖苷融合蛋白。Thomsen D R等在PRV gG基因的启动子下游插入人组织血纤维蛋白溶酶原激活物(tPA)编码的cDNA,并用免疫沉淀分析法和细胞培养中酶活性检测出了表达的tPA。自此以PRV作为表达载体的研究就拉开了序幕。

郭万柱等首次构建了PRV Fa株TK基因缺失株,PRV Fa gI-/gp63-基因缺株,PRV Fa gI-/gp63-/LacZ基因缺失株,还构建了PRV TK-和PRV gp63-/LacZ转移载体,又将构建的gP631acZ转移载体质粒与PRV Fa DNA经磷酸钙转染,在MDBK细胞内同源重组获得PRV Fa gE-/gI-/TK-/LacZ三基因缺失疫苗株(PRV-SA215),PRV-SA215是我国首次成功研制出的Fa-/gI-/TK-/LacZ三基因缺失疫苗株,标志我国在基因工程疫苗研制的领域上取得了重大突破。

方六荣等对含伪狂犬病毒(PRV)鄂A株gG全基因,PK、gD基因部分编码序列的质粒pUSK进行改造,消除了其中的EcoR1位点,将通过PCR扩增的增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)融合到gG启动子下游,构建了由gG启动子控制EGFP表达的PRV转移载体pgG-/EGFP+,该转移载体单独转染或同PRV基因组DNA共转染IBRS-2细胞,结果单独转染时EGFP不能表达;共转染时,6 h就可在荧光显微镜下观察到明显的荧光。

Liu Z等将LacZ基因表达试剂盒插入到PRV Ea株基因组的gE区,通过蓝斑筛选和纯化,得到了TK-/gE-/LacZ+PRV。利用LacZ基因处的EcoRI酶切位点来消化PRV Ea TK-/gE-/LacZ+ 基因组DNA,并与质粒pFBBS在PK-15细胞上进行共转染。经过蚀斑纯化得到了TK-/gE-/gD-PRV。通过小鼠试验表明,此TK-/gE-/gD-PRV的毒力明显减弱。

钱平等将来自质粒pFSV40的300 bp BamHI/PstI片段[其中含有SV40 poly(A)和部分多克隆位点]插入到质粒pUSK相应的酶切位点中,获得重组质粒pUSKSV40,该重组质粒中gG基因5’端编码区缺失了428bp。将来自质粒pcDNA3.l(+)的946bp Bgl II EcoRI片段(其中含CMV启动子及部分多克隆位点)插入到质粒pUSKSV40的BamHI EcoRI位点,构建了通用载体pPRVCMV-uni,其中含有CMV启动子、SV40 poly(A)以及NheI、Pmel、BamHI、BstXI、EcoRI、StuI、XbaI等7个单一克隆位点。将eGFP基因插入到该通用载体的BamHI和EcoRI之间,用所获得的转移载体与TK-/gG-/Lacz+ PRV基因组共转染PK-15细胞,经检测eGFP基因在重组伪狂犬病病毒中获得表达,从而证实了此通用载体构建的可行性。

黄伟坚等以伪狂犬病病毒SH株细胞培养物为模板,用PCR方法扩增蛋白激酶(PK)基因部分片段,克隆到pCDNA3中,序列测定显示所扩增的PK基因片段长907 bp,与PRV NIA-3株的核苷酸同源性为99.6%。把PK基因克隆到pUC19上,利用PK基因中间的SalI酶切位点,插入带有绿色荧光蛋白(EGFP)的基因表达盒,构成了含EGFP的转移载体,为PK基因的功能和构建PK缺失株的进一步研究提供了参考。

胡涛等参考GenBank收录的伪狂犬病病毒gD基因的序列设计了一对引物,对PRV Min-A株进行了PCR扩增,扩增产物克隆于pGEM-T Easy载体。对重组质粒PGTE-gD 进行限制性内切酶分析和基因测序,证实了克隆片段的可靠性。测序结果表明目的片段包含一个1 203 bp的开放性阅读框(ORF),编码400个氨基酸组成的多肽。将gD基因亚克隆至真核表达载体pcDVA3.1-的CMV启动子下游,构建了真核表达质粒pcDNA-gD,为下一步基因免疫奠定了基础。

Xu G等构建了表达乙型脑炎病毒NS1基因的重组PRV 株TK-/gG-/NS1+。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的NS1蛋白,有望作为猪乙型脑炎和伪狂犬病双价基因工程疫苗。

吕素芳等根据伪狂犬病病毒SA株的gI和gE基因序列,设计两对引物,缺失掉gE基因5’端738bp,在克隆测序的基础上,采用酶切方法构建了含部分gE基因的转移载体pBgIE,同时将pBLYFP载体上含CMV启动子、多克隆位点、黄色荧光蛋白(YFP)基因和poly A尾巴的表达盒双酶切后插入到缺失位置,构建出转移载体,命名为pBgIE-YFP。 

徐志文等将包含有完整阅读框架的猪细小病毒VP 2基因(1740 bp)和猪圆环病毒2型ORF 2基因(750 bp)插入到真核表达载体pPI-2.EGFP中,构建出重组质粒pPI-2.EGFP.VP2. ORF2。采用脂质体介导法将重组质粒的DNA和PRV SA2l5株的DNA共转染Vero细胞,转染后20 h出现带荧光的空斑,挑斑纯化后繁殖,并收获病毒液后通过PCR和免疫荧光试验证实,成功构建了重组病毒,将其命名为PRV SA215(D1)株。

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展 望

伪狂犬病毒虽然在过去的十几年时间里依靠缺失疫苗的应用得到有效的控制,但是近年来伪狂犬在各个地区时常有所发生。所以当前对伪狂犬病毒侵染机体突破疫苗产生免疫防护的机制的研究仍然需要深入。随着对伪狂犬病毒研究的逐步深入,其作为重组表达载体的类型也越来越丰富。因伪狂犬病毒具备外源基因容量大、安全性好、免疫期长、宿主范围广、低成本、人类对伪狂犬病病毒没有易感性等特点,可以用于制备二价或多价基因工程疫苗,这样的疫苗可诱导产生的免疫比较广泛,包括体液免疫和细胞免疫、甚至黏膜免疫,可以避免重组亚单位疫苗的很多缺点。由于伪狂犬载体可以同时插入多个外源基因,若能成功插入外源抗原基因且保持载体稳定,就有望达到一针防治多病的目的,进而作为未来疫苗研制与开发的热点和主要方向之一。此外,PRV表达载体还将会在基因表达,基因投递,基因治疗方面具有广泛的应用前景。不可否认,利用伪狂犬载体研制多价基因工程疫苗还需要解决一系列安全性方面的问题,且要与病原特性、发病机理、免疫保护机制及病毒感染的流行病学特点相兼顾,但相信经过进一步的研究,以伪狂犬病病毒为载体研制出的新型疫苗,将会为动物疫病的防控提供强有力的技术支撑。
本文选自《猪业科学》2016年第2期 “猪群保健”栏目中P102-104

(责任编辑:许春霞)
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